基因组的高质量测序--利用长线程测序的力量
NGS在整个生命科学领域得到了广泛应用，但常用的短线程测序方法本质上是模糊的，容易产生GC碱基对偏倚。太平洋生物科学公司(PacBio)利用其单分子实时(SMRT®)技术和Sequel®系统提供更长的读数、均匀的覆盖和高精度。这种专有方法是高级基因组学、全长转录本测序和表观遗传学的理想选择，已被证明对研究SARS-CoV-2病毒的实验室非常有价值，有助于他们了解病毒本身的遗传特性，并描述人类对COVID-19的免疫反应。
长读取测序改进分析
PacBio的Sequel仪器直接在装有零模式波导（ZMW）的SMRT细胞中进行DNA测序，ZMW基本上是非常小的反应容器。带有预结合DNA模板的聚合酶固定在每个ZMW的底部，引入荧光标记的核苷酸开始测序。ZMW由下向上照射，衰减光进入每个ZMW的下部20-30纳米处，当聚合酶将每个碱基整合到原生链时激发荧光团。这使得该系统能够有效地实时 "窃听 "DNA合成过程。PacBio产品管理高级总监Marty Badgett解释了这种方法的优势： "主要优点是读数长、覆盖均匀和共识准确性高。这种准确性得益于低系统误差和读取误差的随机性。例如，在大约10倍覆盖率的情况下，我们可以获得99.9%的准确读数，因为随机误差会从数据中冲掉。”
不断提高的吞吐量
该公司的原始系统 - PacBio RS II - 每个SMRT细胞有150，000个ZMW，相当于约55，000个读数，每次运行可以处理多达16个SMRT细胞。然而，随着NGS变得越来越普遍和具有成本效益，吞吐量仍然是许多客户的限制，导致Sequel系统在2015年10月开发。借助此平台，每个 SMRT 单元包含 100 万个 ZMW，吞吐量提高了 7 倍。 P高级机械设计工程师az Yogev评论说：“当我们开发Sequel系统时，我们希望结合许多额外的液体处理功能，这是PacBio RS II中使用的移液器根本无法提供的。我们研究了多种解决方案，并选择了Tecan的Cavro®空气置换式移液器（ADP），因为它结合了性能、准确性、成本和高级功能，包括自动吸头检测和弹出以及液位检测。 “
Marty补充说：“我们一推出这个平台，就开始研究我们的下一代化学和更高密度的SMRT电池，其中包含800万个ZMW，后来成为Sequel II系统。Sequel此时已经在可靠性方面建立了良好的声誉 - 部分归功于Cavro ADP的移液性能 - 因此我们决定尽可能少地对硬件进行更改。这不仅可以确保平台的持续可靠性，还可以让我们更快地将系统推向市场。
微调性能
“我们的目标是完善仪器的协议，并进一步提高系统的整体鲁棒性，”Marty继续说道。“例如，我们为ADP引入了一些自测试和分析功能，使系统能够识别移液性能的任何恶化，并且至关重要的是，在客户遇到问题时实现远程诊断。我们对ADP的性能没有任何担忧，这种远程监控有助于减少工程师访问客户现场的次数，以解决可能与仪器本身无关的问题。使用 ADP 的内置诊断功能，这非常容易实现，无需我们更改仪器硬件。
长期合作伙伴关系
“我们已经与Cavro ADP合作多年了，这对我们真的很好，”Paz评论道。“从第一个续集系统的制作到续集II系统的最新改进，它一直非常可靠。我们的现场服务工程师会响应客户遇到的任何问题，我们很少需要联系Tecan团队寻求额外的支持，但我们知道，如果我们需要，它就在那里。这种快速反应对我们的研发同样重要。作为一家相对较小的公司，我们试图以极快的速度满足市场需求，我们与Tecan的关系对于实现非常短的仪器开发周期至关重要。如果我们有任何问题，我们总是会得到非常高水平的技术支持。”
COVID-19的广泛应用
NGS一直处于SARS-CoV-2研究的最前沿，为开发分子或免疫测定测试和疫苗的实验室提供了有价值的信息，并为体内观察到的各种免疫反应提供了见解。微生物基因组学、免疫学和传染病市场战略总监 Meredith Ashby 博士解释说：“当 COVID-19 危机显然将成为全球大流行时，我们的 50 多个客户站点（其中许多不是病毒学实验室）表示有兴趣在这一领域工作。为了给我们的客户提供应对这一全球紧急情况的最佳工具，我们开始测试和验证正在出现的各种测序方案。
“随着大流行的进展，很明显，新型冠状病毒对RNA病毒的突变率相对较低，但患者的免疫反应范围以及疾病的严重程度是巨大的。因此，我们的许多客户已转向测序来研究这种变异。Sequel II系统的优势之一是它可以执行高度准确的长读（HiFi读段），提供长达20 kb的测序读段。这对于观察参与免疫反应的人类基因组高度多态性区域以及针对病毒产生的多种抗体来说是一个巨大的优势，我们希望这将有助于快速开发有效的疫苗。整个科学界显然都致力于此，能够尽自己的一份力量真是太好了，“Meredith总结道。
